آزمونهای حیوانی در تحقیقات زیستپزشکی؛ از طراحی مطالعه تا ارزیابی نتایج
یک نتیجه امیدوارکننده در محیط کشت لزوماً به این معنی نیست که همان نتیجه در یک موجود زنده نیز تکرار خواهد شد. یک ماده ممکن است در آزمونهای سلولی سمیت قابل توجهی نشان ندهد، یک نانوحامل در شرایط آزمایشگاهی عملکرد مطلوبی داشته باشد یا یک داربست بتواند چسبندگی و تکثیر سلولها را افزایش دهد؛ اما بدن یک موجود زنده مجموعهای پیچیده از پاسخهای ایمنی، متابولیکی، بافتی و فیزیولوژیک است.
به همین دلیل، در بسیاری از پروژههای زیستپزشکی پس از انجام مطالعات آزمایشگاهی، مرحلهای از ارزیابی in vivo در نظر گرفته میشود. مطالعات حیوانی میتوانند اطلاعاتی درباره اثربخشی، سمیت، پاسخ بافتی، توزیع یک ماده در بدن یا عملکرد یک مداخله درمانی ارائه کنند.
با این حال، استفاده از حیوان آزمایشگاهی بهتنهایی باعث معتبر شدن یک پژوهش نمیشود. بخش مهمی از کیفیت نتایج، قبل از شروع آزمایش و در مرحله طراحی مطالعه حیوانی تعیین میشود.
مطالعه حیوانی چیست؟
مطالعه حیوانی یا Animal Study پژوهشی است که در آن از یک مدل زنده برای بررسی یک سؤال مشخص زیستی یا پزشکی استفاده میشود. این مطالعات میتوانند بخشی از تحقیقات پایه، بررسی بیماریها یا مطالعات پیشبالینی داروها، بیومتریالها، سیستمهای دارورسانی و تجهیزات پزشکی باشند.
هدف مطالعه حیوانی بسته به پروژه متفاوت است. برای مثال، در یک پروژه مهندسی بافت ممکن است میزان بازسازی بافت و پاسخ التهابی بررسی شود، در حالی که در یک مطالعه دارورسانی، اثربخشی درمان، توزیع ماده در بافتهای مختلف یا عوارض احتمالی اهمیت بیشتری دارد.
بنابراین برای همه پروژهها نمیتوان یک مدل یا پروتکل یکسان در نظر گرفت.
چه زمانی باید به سراغ مطالعه حیوانی رفت؟
مطالعه حیوانی معمولاً نباید اولین مرحله ارزیابی یک محصول یا ایده پژوهشی باشد. در بسیاری از پروژهها ابتدا مشخصهیابی ماده و آزمونهای مناسب in vitro انجام میشود تا اطلاعات اولیه درباره عملکرد، سمیت یا سازگاری آن به دست آید.
برای مثال، پیش از بررسی یک داربست مهندسی بافت در مدل حیوانی، ممکن است ابتدا خصوصیات فیزیکی و شیمیایی آن، سمیت سلولی، چسبندگی و تکثیر سلولها و سایر ویژگیهای مرتبط ارزیابی شوند.
پیش از ورود به مرحله حیوانی همچنین باید این سؤال مطرح شود که آیا میتوان پاسخ موردنظر را با روشی جایگزین مانند کشت سلولی، مدلهای سهبعدی، ارگانوئیدها یا سایر مدلهای آزمایشگاهی به دست آورد یا خیر.
این نگاه با اصول 3Rs شامل Replacement، Reduction و Refinement همراستا است؛ چارچوبی که بر جایگزینی حیوان در صورت امکان علمی، کاهش تعداد حیوانات مورد استفاده و اصلاح روشها برای کاهش آسیب و ناراحتی تأکید دارد.
طراحی مطالعه حیوانی از کجا شروع میشود؟
اولین مرحله، انتخاب حیوان نیست؛ بلکه تعریف دقیق سؤال پژوهش است.
فرض کنید سؤال اولیه این باشد:
«آیا این هیدروژل باعث بهبود ترمیم زخم میشود؟»
این سؤال هنوز برای طراحی یک مطالعه مناسب کافی نیست. باید مشخص شود منظور از «بهبود» چیست. آیا کاهش مساحت زخم مدنظر است؟ سرعت اپیتلیالیزاسیون اهمیت دارد؟ میزان التهاب بررسی خواهد شد؟ یا تشکیل عروق و ساختار بافت جدید اهمیت بیشتری دارد؟
پاسخ به این سؤالها مشخص میکند چه متغیرهایی باید اندازهگیری شوند، مطالعه چه مدت ادامه پیدا کند و چه نوع مدل حیوانی مناسبتر است.
به همین دلیل، یک طراحی آزمون حیوانی مناسب از سؤال پژوهش آغاز میشود، نه از تعداد حیواناتی که در دسترس پژوهشگر قرار دارند.
انتخاب مدل حیوانی مناسب
یکی از مهمترین مراحل در طراحی مطالعه، انتخاب مدل حیوانی است.
موش، رت، خرگوش یا سایر مدلهای آزمایشگاهی صرفاً حیواناتی با اندازههای متفاوت نیستند. تفاوتهای آناتومیک، فیزیولوژیک، متابولیکی و ایمنی بین گونهها میتواند بر نتیجه پژوهش تأثیر بگذارد.
حتی در یک گونه نیز عواملی مانند سویه، جنس، سن، وزن و شرایط فیزیولوژیک حیوان ممکن است در نتیجه مطالعه نقش داشته باشند. راهنمای ARRIVE نیز توصیه میکند مشخصات حیوانات از جمله گونه، سویه، جنس و سن یا مرحله رشدی بهطور شفاف گزارش شوند.
بنابراین سؤال اصلی نباید صرفاً این باشد که «موش بهتر است یا رت؟» بلکه باید بررسی شود کدام مدل میتواند سؤال پژوهشی موردنظر را بهتر نمایندگی کند.
برای مثال، مدل مناسب برای مطالعه ترمیم زخم الزاماً همان مدلی نیست که برای بررسی یک بیماری متابولیک، سرطان یا پاسخ به یک ایمپلنت انتخاب میشود.
در پروژههای دارورسانی، مدلهای حیوانی میتوانند برای بررسی اثربخشی درمان، توزیع بافتی و رفتار سامانه در شرایط in vivo مورد استفاده قرار گیرند. برای آشنایی بیشتر با این حوزه، میتوانید خدمات دارورسانی و نانودارو کوادسل را مشاهده کنید.
گروههای کنترل چرا اهمیت دارند؟
نتیجه یک مداخله زمانی قابل تفسیر است که بتوان آن را با شرایط مناسبی مقایسه کرد.
بسته به هدف مطالعه ممکن است از گروه کنترل بدون درمان، Vehicle Control، Sham Control یا Positive Control استفاده شود. انتخاب کنترل باید متناسب با سؤال پژوهش انجام شود و اضافه کردن گروههای متعدد بدون دلیل علمی لزوماً کیفیت مطالعه را افزایش نمیدهد.
برای مثال، اگر خود فرآیند جراحی بتواند بر نتیجه تأثیر بگذارد، وجود گروه Sham میتواند برای تفکیک اثر جراحی از اثر مداخله اصلی ضروری باشد.
در طراحی مناسب، هر گروه باید پاسخگوی یک سؤال مشخص باشد. NC3Rs نیز تأکید میکند انتخاب گروههای کنترل یا Comparator باید بر اساس هدف آزمایش انجام شود.
در هر گروه چند حیوان لازم است؟
این یکی از رایجترین سؤالها در مطالعات پیشبالینی حیوانی است، اما پاسخ آن یک عدد ثابت مانند پنج، شش یا هشت حیوان نیست.
تعداد نمونه حیوانی به عواملی مانند نوع طراحی، متغیر اصلی مطالعه، میزان پراکندگی دادهها، اندازه اثر مورد انتظار و روش آماری بستگی دارد.
استفاده از تعداد بسیار کم حیوان ممکن است باعث شود مطالعه توان کافی برای شناسایی یک اثر واقعی نداشته باشد. در مقابل، استفاده از تعداد بیشتر از نیاز نیز از نظر علمی و اخلاقی مطلوب نیست.
در مطالعات فرضیهمحور میتوان از روشهایی مانند محاسبه توان آماری یا Power Analysis برای برآورد حجم نمونه استفاده کرد. NC3Rs نیز توصیه میکند تعداد نمونه صرفاً از روی تعداد حیوانات استفادهشده در مقالههای قبلی انتخاب نشود.
نکته مهم دیگر مفهوم Experimental Unit است. واحد آزمایشی همیشه الزاماً یک حیوان نیست و باید مشخص شود مداخله به چه واحدی بهطور مستقل اعمال شده است. اشتباه در تعریف واحد آزمایشی میتواند تحلیل آماری مطالعه را نیز تحت تأثیر قرار دهد.
در پروژههای مهندسی بافت، ارزیابی عملکرد یک بیومتریال تنها به بررسی پاسخ حیوانی محدود نمیشود و معمولاً لازم است ویژگیهایی مانند زیستسازگاری، تخریبپذیری، رفتار سلولی و خواص ساختاری ماده نیز بررسی شوند. برای آشنایی بیشتر با این خدمات، میتوانید صفحه مهندسی بافت و بیومتریال کوادسل را مشاهده کنید.
Randomization و Blinding چه نقشی دارند؟
یکی از مشکلات مطالعات تجربی، احتمال ورود سوگیری یا Bias به فرآیند پژوهش است.
در Randomization یا تصادفیسازی، حیوانات یا واحدهای آزمایشی با روشی تصادفی بین گروههای مختلف تقسیم میشوند. این کار احتمال ایجاد تفاوت سیستماتیک میان گروهها را کاهش میدهد.
در Blinding یا کورسازی نیز فردی که نتیجه را ارزیابی میکند، در صورت امکان از گروه نمونه اطلاع ندارد.
فرض کنید پژوهشگر تصاویر هیستوپاتولوژی دو گروه را بررسی میکند. اگر بداند کدام تصویر متعلق به گروه درمان است، ممکن است ناخودآگاه ارزیابی او تحت تأثیر انتظار قبلی قرار گیرد.
Randomization و Blinding از موضوعات اصلی مورد تأکید ARRIVE 2.0 و منابع طراحی آزمایش NC3Rs هستند.
چه نتایجی در مطالعه حیوانی ارزیابی میشوند؟
نوع ارزیابی نتایج حیوانی مستقیماً به هدف پروژه وابسته است.
در یک مطالعه ترمیم زخم ممکن است درصد بستهشدن زخم، ساختار بافت، میزان التهاب، تشکیل عروق یا اپیتلیالیزاسیون بررسی شود. در پروژههای مهندسی بافت و بیومتریال، پاسخ بافتی، تخریب ماده، فیبروز یا تشکیل بافت جدید میتواند اهمیت داشته باشد.
در مطالعات دارویی و سیستمهای دارورسانی ممکن است اثربخشی درمان، فارماکوکینتیک، توزیع بافتی، تغییرات وزن، شاخصهای خونی یا وضعیت اندامهای مختلف بررسی شوند.
بهتر است پیش از شروع پروژه، Primary Outcome یا متغیر اصلی مطالعه مشخص شود. سایر اندازهگیریها میتوانند بهعنوان Secondary Outcomes اطلاعات تکمیلی در اختیار پژوهشگر قرار دهند.
این کار از جمعآوری تعداد زیادی داده بدون سؤال مشخص جلوگیری میکند و تحلیل آماری مطالعه را نیز هدفمندتر میسازد.
تحلیل نتایج؛ فقط P-value مهم نیست
تحلیل آماری نباید مرحلهای باشد که بعد از پایان مطالعه درباره آن تصمیم گرفته شود.
نوع متغیرها، تعداد گروهها، Experimental Unit و ساختار اندازهگیریها باید پیش از شروع آزمایش در نظر گرفته شوند تا روش آماری متناسب با طراحی انتخاب شود.
در تفسیر نتایج نیز نباید تنها به این موضوع توجه کرد که P-value کمتر از 0.05 است یا خیر. اندازه اثر، پراکندگی دادهها، فاصله اطمینان و اهمیت زیستی تفاوت مشاهدهشده نیز میتوانند برای تفسیر نتیجه مهم باشند.
یک تفاوت آماری کوچک الزاماً به معنای یک تغییر زیستی مهم نیست و از سوی دیگر، نبود اختلاف معنیدار در یک مطالعه با توان پایین نیز بهتنهایی نبود اثر را اثبات نمیکند.
اصول اخلاقی در مطالعات حیوانی
اخلاق در مطالعات حیوانی بخشی جداییناپذیر از طراحی پژوهش است.
مطالعات باید مطابق الزامات قانونی و اخلاقی محل انجام پژوهش و پس از دریافت تأییدهای لازم انجام شوند. همچنین اصول 3Rs باید از مرحله طراحی مورد توجه قرار گیرند.
Replacement به استفاده از روشهای جایگزین در صورت امکان اشاره دارد. Reduction به معنای استفاده از تعداد مناسب حیوانات برای دستیابی به یک نتیجه علمی معتبر است و Refinement بر اصلاح شرایط و روشها برای کاهش درد، استرس و آسیب تمرکز دارد.
توجه به این اصول فقط یک الزام اخلاقی نیست؛ طراحی بهتر مطالعه معمولاً به دادههای قابل اعتمادتر نیز منجر میشود.
ARRIVE چیست؟
ARRIVE مخفف Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments است و مجموعهای از دستورالعملها برای گزارش شفاف مطالعات حیوانی ارائه میکند.
در نسخه ARRIVE 2.0 موضوعاتی مانند طراحی مطالعه، حجم نمونه، معیارهای ورود و خروج، Randomization، Blinding، Outcome Measures، روشهای آماری، مشخصات حیوانات و نحوه گزارش نتایج مورد توجه قرار گرفتهاند.
اگرچه ARRIVE در اصل یک راهنمای گزارشنویسی است، استفاده از آن در مرحله طراحی پژوهش نیز میتواند کمک کند بسیاری از مشکلات احتمالی مطالعه قبل از شروع آزمایش مشخص شوند.
اشتباهات رایج در مطالعات حیوانی
انتخاب مدل صرفاً بر اساس در دسترس بودن حیوان، تعیین تعداد نمونه بدون توجیه علمی، مشخص نبودن متغیر اصلی مطالعه، نبود گروه کنترل مناسب، انجام ندادن تصادفیسازی، تعریف نکردن معیارهای خروج و انتخاب روش آماری پس از مشاهده دادهها از مشکلاتی هستند که میتوانند اعتبار یک مطالعه حیوانی را کاهش دهند.
بخش قابل توجهی از این مشکلات را میتوان پیش از شروع آزمایش و با یک طراحی دقیق برطرف کرد.
جمعبندی
یک مطالعه حیوانی موفق صرفاً به انجام یک مداخله روی حیوان آزمایشگاهی محدود نمیشود. کیفیت مطالعه از زمان تعریف سؤال پژوهش آغاز میشود و به انتخاب مدل مناسب، طراحی گروهها، تعیین حجم نمونه، کاهش سوگیری، تعریف شاخصهای ارزیابی و تحلیل صحیح دادهها وابسته است.
در بسیاری از تحقیقات زیستپزشکی، مطالعات in vitro و in vivo باید بهعنوان بخشهایی از یک مسیر پیوسته دیده شوند؛ بهطوری که نتایج هر مرحله به طراحی مرحله بعد کمک کند.
هرچه این مسیر پیش از شروع آزمایش دقیقتر طراحی شود، احتمال انجام آزمایشهای غیرضروری کاهش مییابد و امکان دستیابی به نتایج معتبر، قابل تفسیر و قابل انتشار بیشتر خواهد شد.
پرسش و پاسخهای متداول (FAQ)
آیا همه پروژههای زیستپزشکی به آزمون حیوانی نیاز دارند؟
خیر. در بسیاری از پروژهها ابتدا باید امکان استفاده از روشهای in vitro یا سایر روشهای جایگزین بررسی شود. نیاز به مطالعه حیوانی به سؤال پژوهش و اطلاعات موردنیاز بستگی دارد.
برای هر گروه حیوانی چند حیوان لازم است؟
عدد ثابتی وجود ندارد. تعداد نمونه باید با توجه به طراحی مطالعه، Outcome اصلی، اندازه اثر مورد انتظار، پراکندگی دادهها و روش آماری تعیین شود.
بهترین مدل حیوانی برای یک مطالعه چیست؟
مدل واحدی که برای همه پروژهها بهترین باشد وجود ندارد. انتخاب مدل باید متناسب با سؤال پژوهش، نوع بیماری یا بافت هدف و شاخصهای مورد ارزیابی انجام شود.
ARRIVE در مطالعات حیوانی چیست؟
ARRIVE مجموعهای از دستورالعملها برای گزارش شفاف و کامل پژوهشهای حیوانی است و موضوعاتی مانند طراحی مطالعه، حجم نمونه، تصادفیسازی، کورسازی و تحلیل آماری را پوشش میدهد.
اگر برای طراحی مطالعه، انتخاب مدل مناسب یا اجرای بخشی از پروژه پژوهشی خود نیاز به مشاوره دارید، میتوانید با تیم کوادسل تماس بگیرید.
