آلودگی و اسپتیک
آسپتیک همواره زدوده شدن همه آلودگیها از ابزار و مواد آزمایشگاهی را گارانتی نمیکند. هومئوستاز کالچر سلولی، شکننده و آسیبپذیر است و شناسایی و حذف عواملی که منجر به مرگ یک کالچر شده، منجر به اصلاح و بهبود رویه و تضمین سلامت کالچر بعدی میشود.
مایکوپلاسما
از انواع آلودگیهای بیولوژیکی، واقعگرایانه، شناسایی مایکوپلاسما، از چالشهای کشت سلول میباشد. بر خلاف قارچها و باکتریهای دیگر، مایکوپلاسما، در سطح زیر سلولی فعالیت میکنند، تاثیری بر متابولیسم سلول ندارند و میتوانند بدون به وجود آوردن آسیب قابل مشاهده به سلولها، در محیط کشت باقی بمانند.
مایکوپلاسما، سَردهای از دامنه باکتریها، پروکاریوتهایی بدون دیواره سلولی میباشند. دادههای ژنتیکی آنها در یک رشته دِنا، غوطهور و بدون محافظ قرار دارد. فقدان دیواره سلولی، موجب مقاومت بالای آنها به آنتیبیوتیکها شده و شعاع زیرمیکرونی آنها مشاهده، دقیق آنها را زیر میکروسکوپ نوری ناممکن میکند.
در ردههای سلولی آلوده، نزدیک به بیست گونه مایکوپلاسما شناسایی شده است و بررسیهای دقیق این گونهها نشان داده که نزدیک به 90-95% آنها به گونههای M.orale, M.hyporhinis, M.arginini, M.fermentans, A.Laidlawii تعلق دارند. M.orale رایجترین آلودگی مایکوپلاسمایی در کالچرهای سلولی است و نماینده 20-40% عفونتهای ردهها میباشد و مانند گونههای M. fermentans و M. hominis منبع انسانی دارند. گروه گاوی مایکوپلاسما، نیز منبع 30% عفونتهای سلولی هستند: M.arginini و A.Laidlawii.
حدف و جلوگیری از انتشار مایکوپلاسما
- مدیا و محیط کشت آلوده که قابل اتوکلاو نیستند. فیلتر درست مدیا از مراحل مهم محافظت از رده سلولی میباشد.
- کارکنان ازمایشگاه نیز با پخش گرد و خاک و ذرات معلق ناقلی که از طریق صحبت، عطسه و یا روپوشهای شسته نشده در محیط پخش میشوند و میتوانن منشاء مایکوپلاسما باشند. رعایت اصول خوب آزمایشگاهی، اهمیت بالایی دارند.
- نکته جذاب راجع به مایکوپلاسما، بقای آن در نیتروژن مایع می باشد. هر چند که مایکوپلاسما نمیتوانند در نیتروژن مایع تکثیر شوند، با این حال میتوانند ویالها را آلوده کنند. بنابراین فریز و دفریز سلولها باید با دقت بالا انجام شوند.
رنگآمیزی Dapi
جهت کسب اطلاعات بیشتر در رابطه آزمون رنگ آمیزی DAPI به این بخش سر بزنید.
درلینک بالا به کاربرد، عملکرد و رویه استفاده از DAPI پرداخته شده است. خاصیت فلورسنت این مولکول و اتصال آن به نواحی غنی از بازهای آدنین–تیمین (A-T) کاربردهای وسیعی به آن میبخشد. علاوه بر شمارش سلولها، بررسی سلامت و مرگ سلولی و نشانگر در فلوسایتومتری، از DAPI میتوان برای یافتن آلودگیهای باکتریایی استفاده کرد.
در کالچرهای سالم، دِنای هستههای سلولی، به سرعت مولکولهای DAPI را جذب کرده و پس از انکوبه در محلول 0.1 mg/mL PBS، به مدت 15 تا 30 دقیقه، محتویات سلولی در ریز میکروسکوپ دارای تشعشعات متمرکز آبی رنگ دیده میباشند و فاقد هر گونه فلورسنس در سیتوپلاسم دیده نمیشود. در صورت آلودگی مایکوپلاسما، کانونهای مجزا و مشخص فلورسنت در اطراف سلولها، سیتوپلاسم و سطح سلولها دیده میشوند. بر این اساس، DAPI یک ابزار ساده و کارا برای شناسایی آلودگیها میباشد. با این حالا این روش، دارای محدودیت از جمله وابسته بودن تحلیل نتایج آزمایش به تجربه و مهارت اُپراتور و ناتوانی تشخیص آلودگی با غلظت پایین.
روش PCR
PCR، واکنش زنجیرهای پلیمراز، فنی در زستشناسی مولکولی است و از ابداع آن در سال ۱۹۸۳ توسط کری مایلس کاربردهای فراوانی در تمام حوزههای مهندسی پزشکی پیدا کرده است. PCR، بر اساس باز تولید میلیونها نسخه از قسمت ژنوم کار میکند، به طوری که مقادیر ناچیز از کد ژنتیکی قابل مشاهده و اندازهگیری شده و وجود و یا عدم وجود آنها تعیین میشود.
در مواقعی که به روشی سریعتر برای شناسایی مایکوپلاسما نیاز است، PCR روشی مناسب است. مایکوپلاسما، به طور کلی توسط پلیمراز قسمت 16S rRNA ژنوم مایکوپلاسما استفاده میشود. نسبت به دو روش دیگر، بسیار حساستر است و قابلیت شناسایی مایکوپلاسما در غلظتهای بسیار پایین دارد نتایج حساستر و دقیقتری در مدت کوتاه ارائه میدهد.
روش مبتنی بر کشت
روش دیگر شناسایی مایکوپلاسما، مبتنی بر کشت میباشد. این روش معیار مرسوم دارو نامههای اُروپایی، ایالات متحده آمریکا و ژاپن و روش مورد اعتماد بازرسی کالچرها میباشد.
در این روش محیطهای کشت طراحی شده برای ازدیاد باکتری، به نمونههایی از کالچر، آغشته شده و در یک ظرف آگار رشد داده میشود. ابتنا بر کشت باکتریایی، روشی مستقیم برای بازرسی آلودگی مییاشد اما با این حال، نمونههای آگار نیاز به زمان دارند و تنها پس از دو هفته، یا یک ماه برای بررسی آلودگی مایکوپلاسما آنکوبه، میتوانند استفاده شوند.
پرسش و پاسخهای متداول (FAQ)
چرا شناسایی مایکوپلاسما در کشت سلول مشکل میباشد؟
مایکوپلاسما با چشم غیرمسلح و حتی با استفاده از میکروسکوپ معکوس قابل مشاهده نیست. همچنین، برخلاف بسیاری از آلودگیهای میکروبی، معمولاً باعث ایجاد کدورت یا تغییرات آشکار در محیط کشت سلول نمیشود و به همین دلیل شناسایی آن میتواند دشوار باشد.
شناسایی آلودگی مایکوپلاسما چگونه انجام میشود؟
روشهای رایج برای شناسایی آلودگی مایکوپلاسما شامل روشهای مبتنی بر کشت، انواع روشهای PCR و رنگآمیزی DAPI هستند. انتخاب روش مناسب به هدف آزمایش، سرعت مورد نیاز و سطح حساسیت مورد انتظار بستگی دارد.
تست شناسایی مبتنی بر کشت چقدر زمان میبرد؟
روشهای شناسایی مایکوپلاسما مبتنی بر کشت به زمان نسبتاً طولانی نیاز دارند. در این روش، نمونه ممکن است به حدود یک ماه زمان برای رشد و شناسایی مایکوپلاسما نیاز داشته باشد.
دلیل استفاده وسیع از روش PCR در بررسی آلودگی مایکوپلاسما چیست؟
روشهای مبتنی بر PCR به دلیل سرعت بالا و حساسیت بسیار مناسب، کاربرد گستردهای در شناسایی آلودگی مایکوپلاسما دارند. این روشها امکان شناسایی دقیق مایکوپلاسما را در مدت زمان کوتاه، حتی در غلظتهای پایین، فراهم میکنند.
آیا رنگآمیزی DAPI میتواند بهطور قابل اعتماد آلودگی مایکوپلاسما را شناسایی کند؟
رنگآمیزی DAPI روشی سریع برای بررسی آلودگی مایکوپلاسما است، اما تفسیر و تحلیل نتایج آن بدون تجربه کافی میتواند چالشبرانگیز باشد؛ بهخصوص زمانی که میزان آلودگی پایین باشد. بنابراین، برای افزایش اطمینان از نتیجه، استفاده از روشهای حساستر و اختصاصیتر مانند PCR نیز میتواند توصیه شود.
از سلامت کشت سلولی خود مطمئن شوید.
آلودگی مایکوپلاسما میتواند بدون ایجاد تغییرات ظاهری مشخص، نتایج آزمایشهای سلولی شما را تحت تأثیر قرار دهد. اگر درباره سلامت نمونهها یا کشت سلولی خود تردید دارید، با تیم کوادسل در ارتباط باشید تا برای انتخاب روش مناسب بررسی و تشخیص مایکوپلاسما راهنمایی شوید.
