پروتکل استخراج و کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان (BM-MSC)
سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان (Bone Marrow Mesenchymal Stromal/Stem Cells یا BM-MSCs) از پرکاربردترین سلول‌ها در تحقیقات مهندسی بافت و پزشکی بازساختی هستند.
برای استخراج این سلول‌ها از مغز استخوان انسان، می‌توان ابتدا گلبول‌های قرمز نمونه را با بافر RBC Lysis حذف کرد و سپس سلول‌های باقی‌مانده را در محیط کشت مناسب قرار داد. سلول‌های استرومایی چسبنده به سطح فلاسک متصل می‌شوند و با تعویض محیط و تکثیر تدریجی می‌توان جمعیتی غنی‌شده از BM-MSCها به دست آورد.
در ادامه، یک پروتکل کاربردی مبتنی بر روش لیز گلبول قرمز ارائه شده است.
مواد و تجهیزات موردنیاز
نمونه آسپیره مغز استخوان انسان، جمع‌آوری‌شده در شرایط استریل و همراه با ماده ضدانعقاد
بافر لیز گلبول قرمز (RBC Lysis Buffer)
محیط کشت DMEM Low Glucose
سرم FBS با غلظت نهایی ۱۰٪ و آنتی‌بیوتیک/آنتی‌مایکوتیک ۱٪
PBS استریل، تریپسین و فلاسک کشت T25
سانتریفیوژ، هود ایمنی زیستی کلاس II و انکوباتور CO₂
مراحل استخراج سلول مزانشیمی از مغز استخوان
مرحله ۱: آماده‌سازی نمونه
حدود ۲ میلی‌لیتر آسپیره مغز استخوان را که در لوله حاوی ماده ضدانعقاد جمع‌آوری شده است، برای جداسازی سلولی آماده کنید. نمونه باید با رضایت آگاهانه و مجوزهای لازم تهیه و با رعایت الزامات ایمنی زیستی پردازش شود.
مرحله ۲: لیز گلبول‌های قرمز
به ۲ میلی‌لیتر نمونه مغز استخوان، ۱۰ میلی‌لیتر بافر RBC Lysis اضافه کنید (نسبت نمونه به بافر ۱:۵).
مخلوط را طبق پروتکل مطالعه مرجع به مدت ۲ دقیقه در دمای اتاق قرار دهید. زمان تماس باید با نوع بافر مصرفی سازگار باشد.
مرحله ۳: سانتریفیوژ و شست‌وشو
نمونه را به مدت ۵ دقیقه با نیروی 480 × g سانتریفیوژ کنید.
مایع رویی را حذف کرده و رسوب سلولی را با حدود ۲ میلی‌لیتر محیط DMEM Low Glucose شست‌وشو دهید. در صورت نیاز شست‌وشو را تکرار کنید.
مرحله ۴: کشت اولیه سلول‌ها
رسوب سلولی را در محیط کشت کامل شامل DMEM-LG، ده درصد FBS و یک درصد آنتی‌بیوتیک/آنتی‌مایکوتیک معلق کرده و به فلاسک T25 منتقل کنید.
فلاسک را در انکوباتور با شرایط زیر قرار دهید:
دما: ۳۷ درجه سانتی‌گراد
غلظت CO₂: پنج درصد
رطوبت: حدود ۹۵ درصد
مرحله ۵: حذف سلول‌های غیرچسبنده
پس از ۲۴ ساعت، سلول‌های غیرچسبنده را با تعویض آرام محیط حذف کنید.
در ادامه، محیط کشت را هر ۳ تا ۴ روز تعویض کرده و وضعیت سلول‌ها را با میکروسکوپ معکوس بررسی کنید.
مرحله ۶: تکثیر و پاساژ سلول‌ها
معمولاً طی روزهای ۵ تا ۷، کلونی‌هایی با مورفولوژی دوکی‌شکل و فیبروبلاست‌مانند مشاهده می‌شوند.
در مطالعه مرجع، سلول‌ها طی حدود ۱۰ تا ۱۴ روز به تراکم نزدیک ۸۰٪ رسیدند؛ البته سرعت رشد به ویژگی‌های نمونه و شرایط کشت بستگی دارد.
با رسیدن سلول‌ها به تراکم مناسب، می‌توان آن‌ها را پس از شست‌وشو با PBS و جداسازی با تریپسین، به فلاسک جدید منتقل کرد.
چگونه هویت سلول‌های مزانشیمی را تأیید کنیم؟
ظاهر دوکی‌شکل و چسبندگی به فلاسک به‌تنهایی برای تأیید BM-MSC بودن سلول‌ها کافی نیست.
بر اساس معیارهای ISCT، تأیید هویت سلول‌های مزانشیمی انسانی شامل موارد زیر است:
| شاخص | نتیجه مورد انتظار |
|---|---|
| CD73، CD90، CD105 | مثبت (حداقل ۹۵٪) |
| CD34، CD45، CD14/CD11b، CD19/CD79α، HLA-DR | منفی (حداکثر ۲٪) |
| قابلیت تمایز | به رده‌های استخوانی، چربی و غضروفی |
بررسی مارکرهای سطحی با فلوسایتومتری و آزمون‌های تمایز سه‌گانه برای مشخصه‌یابی سلول‌ها کاربرد دارند.
سؤالات متداول
آیا برای استخراج سلول مزانشیمی از مغز استخوان حتماً به فایکول نیاز است؟
خیر. علاوه بر روش گرادیان چگالی فایکول (Ficoll)، روش لیز گلبول قرمز نیز برای جداسازی و کشت BM-MSCها استفاده می‌شود. روش لیز می‌تواند برای نمونه‌های کم‌حجم گزینه کاربردی‌تری باشد.
چه محیط کشتی برای سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان مناسب است؟
محیط‌های DMEM Low Glucose و α-MEM از گزینه‌های مورد استفاده در کشت BM-MSC هستند. انتخاب محیط به پروتکل، منبع سلولی و شرایط آزمایش بستگی دارد.
آیا سلول‌های استخراج‌شده بلافاصله خالص هستند؟
خیر. کشت اولیه شامل جمعیت‌های سلولی مختلف است. چسبندگی به پلاستیک و پاساژهای بعدی به غنی‌سازی سلول‌های استرومایی کمک می‌کنند، اما تأیید هویت آن‌ها به آزمون‌های مشخصه‌یابی نیاز دارد.
منابع علمی
-
Dash A, et al. (2026). A Rapid and Cost-Effective Erythrocyte Lysis Based Method for Isolation and Characterization of Human Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. DOI: 10.1007/s12288-026-02609-y
-
Dzubanova M, et al. (2025). Protocol for isolation of human bone marrow stromal cells and characterization of cellular metabolism. STAR Protocols, 6(1), 103553. DOI: 10.1016/j.xpro.2024.103553
-
Dominici M, et al. (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy, 8(4), 315–317. DOI: 10.1080/14653240600855905
به استخراج و کشت سلول‌های مزانشیمی نیاز دارید؟
برای دریافت خدمات جداسازی، کشت و تکثیر سلول‌های مزانشیمی، مشخصات نمونه و نیاز پژوهشی خود را برای کوادسل ارسال کنید تا امکان انجام خدمات بررسی شود.
