ماکروفاژها از سلولهای کلیدی سیستم ایمنی ذاتی هستند که بسته به سیگنالهای محیطی، میتوانند به فنوتیپهای مختلفی مانند حالت «التهابی» (M1) یا «ترمیمی / ضدالتهاب» (M2) گرایش پیدا کنند. در شرایط تحریک با عوامل میکروبی یا التهابی مانند لیپوپلیساکارید (LPS) و اینترفرون-گاما، ماکروفاژها وارد فاز التهابی شده و مولکولهای التهابی شامل نیتریکاکسید (NO)، سایتوکاینهای التهابی (مانند TNF-α, IL-6, IL-1β) و آنزیمهایی چون iNOS و COX-2 را تولید میکنند.
آزمونهای ضدالتهابی مبتنی بر ماکروفاژ (Macrophage Anti-inflammatory Assay) در سالهای اخیر به عنوان یک روش غربالگری اولیه برای بررسی اثر ترکیبات جدید (دارویی، طبیعی، نانوذرات و غیره) بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند. مطالعات نشان دادهاند که فعالیت ضدالتهابی سلولها در این آزمایش in vitro میتواند با فعالیت ضدالتهابی in vivo همبستگی داشته باشد.
در راهنمایی جدیدی که در ژورنال Wiley منتشر شده، اصول و نکات فنی اجرای آزمونهای ضدالتهاب در رده RAW264.7 مرور شده است تا آزمایشگران یک روش معتبر، تکرارشونده و دقیق داشته باشند.
کاربردهای آزمون ضدالتهابی ماکروفاژ
- داروسازی: غربالگری ترکیبات ضدالتهابی جدید
- گیاهان دارویی: سنجش پتانسیل درمانی عصارهها و متابولیتها
- زیستفناوری و نانوپزشکی: ارزیابی اثر بیومتریالها و نانوذرات
- تحقیقات پزشکی: مطالعه مکانیسم بیماریهای مرتبط با التهاب
مزایا:
- روشی سریع، مقرونبهصرفه و استاندارد برای بررسی اولیه
- امکان اندازهگیری طیف وسیعی از نشانگرهای التهابی
- کاربرد در حوزههای مختلف از داروسازی تا پزشکی بازساختی
محدودیتها:
× شرایط in vitro سادهتر از واقعیت بدن است.
× برای تایید نتایج نیاز به آزمونهای in vivo وجود دارد.
روش آزمون ضدالتهاب مدل ماکروفاژ
در زیر روش کلی و نکات کلیدی این آزمون را مرحلهبهمرحله توضیح میدهیم:
انتخاب رده سلولی و شرایط کشت
- برای مدلهای ماکروفاژی معمول، از ردههایی مانند RAW 264.7 (موشی) یا THP-1 مشتقشده به ماکروفاژ (در انسان) استفاده میشود.
- سلولها در محیط کشت متداول (مثلاً DMEM یا RPMI همراه با مکملهای FBS، آنتیبیوتیک) در دمای 37 درجه سانتیگراد و CO₂ ~5٪ نگهداری میشوند.
- تعداد سلولها باید به حدی انتخاب شود که پس از تحریک و تیمار، وضعیت زندهمانی کافی داشته باشند (مثلاً ۵×10⁴ تا ۱۰×10⁴ سلول در چاهک 96-چاهکی، بسته به طراحی آزمایش).
ارزیابی سمیت اولیه (cell viability / cytotoxicity)
قبل از اینکه ترکیب مورد نظر را در شرایط التهابی بررسی کنیم، باید مطمئن شویم که آن ترکیب غیرسمی است. معمولاً با روشهایی مانند MTT، MTS یا CCK-8 سلولها را تیمار میکنند و بیان زندهمانی را سنجیده و غلظتهایی را که موجب کاهش زیاد زندهمانی نمیشوند انتخاب میکنند.
القای حالت التهابی (Polarization to M1)
- به سلولها LPS به غلظت مناسب (مثلاً 100 ng/mL یا 1 µg/mL بسته به رده و پروتکل) افزوده میشود تا ماکروفاژها به فنوتیپ M1 وارد شوند و مولکولهای التهابی تولید کنند.
- در برخی روشها، ترکیب LPS + IFN-γ نیز استفاده میشود تا تحریک قویتری ایجاد شود.
- زمان القاء معمول بین ۱۲ تا ۲۴ ساعت است، اما بسته به آزمایش ممکن است کمتر یا بیشتر شود.
تیمار با ترکیبات مورد بررسی
- پس از القای التهاب (یا گاهی به طور همزمان با القاء)، ترکیب مورد مطالعه در غلظتهای مختلف به چاهکها اضافه میشود.
- زمان تیمار معمولاً ۱۲ تا ۲۴ ساعت است، اما میتواند بسته به هدف و داینامیک پاسخ سلولی کوتاهتر یا بلندتر باشد.
- یک کنترل منفی (ماکروفاژ بدون LPS)، کنترل مثبت (با LPS، بدون تیمار) و در برخی موارد کنترل دارو مرجع (مثلاً دگزامتازون یا NSAID شناختهشده) به کار میرود.
سنجش شاخصهای التهابی
بسته به اهداف آزمایش، چند نوع شاخص قابل اندازهگیری هستند:
- تولید نیتریکاکسید (NO):
سوپرانتانتهای کشت جمعآوری میشوند و با روش Griess assay مقدار نیترات/نیتریت تولیدشده اندازهگیری میشود. کاهش NO نشاندهنده اثر ضدالتهابی احتمالی است.
- سایتوکاینهای التهابی در محیط کشت:
با استفاده از کیت ELISA، میزان TNF-α، IL-6، IL-1β و سایر سایتوکاینها اندازهگیری میشود. کاهش این مقادیر نشاندهنده فعالیت ضدالتهابی ترکیب است.
- بیان ژن (mRNA) ژنهای التهابی:
از روش RT-qPCR استفاده میشود تا میزان رونویسی iNOS, COX2, TNF-α, IL-6, IL-1β و ژنهای تنظیمی مانند NF-κB یا مسیرهای MAPK را بررسی کنیم. کاهش سطح mRNA نسبت به کنترل التهابی میتواند مدرکی بر تأثیر ضدالتهابی باشد.
- بیان پروتئینی مولکولهای سیگنالدهی:
با روش وسترن بلات میتوان بررسی کرد که آیا تیمار بر مسیرهای سیگنالی مانند NF-κB (فاکتور هستهای κB)، MAPKs (ERK, JNK, p38) یا IκBα اثر داشته است. برای مثال، برخی مطالعات نشان دادهاند ترکیبات ضدالتهابی با کاهش فسفوریلاسیون p65 و مهار انتقال هستهای NF-κB مؤثرند.
- سایر شاخصهای مکمل:
ممکن است اندازهگیری تولید ROS (اکسیدهای فعال نیتروژنی)، بررسی مورفولوژی سلولی یا آزمایشهای فلوسایتومتری (برای بررسی بیان CD markers) نیز انجام شود.
تحلیل داده و تکرار
- نتایج گروههای تیمار شده را با گروه کنترل التهابی مقایسه میکنیم (با آزمونهای آماری مناسب مانند ANOVA یا t-test).
- معمولاً اثرات وابسته به دوز بررسی میشوند تا نصف غلظت القایی (IC₅₀) یا بازده مهار (%) تعیین شود.
- تکرار مستقل (سه یا بیشتر) توصیه میشود تا قابلیت اطمینان نتایج افزایش یابد.
آزمون ضدالتهابی مبتنی بر ماکروفاژ یک روش علمی و کاربردی برای ارزیابی اثرات ترکیبات مختلف بر کاهش التهاب است. این مدل بهویژه برای شرکتهای داروسازی، مراکز تحقیقاتی و صنایع مرتبط با گیاهان دارویی و نانوذرات اهمیت دارد.
در آزمایشگاه کوادسل این آزمون با استفاده از ردههای سلولی معتبر، روشهای مولکولی دقیق و تیم متخصص انجام میشود تا محققان و شرکتها بتوانند دادههای معتبر و قابل استناد برای پروژههای تحقیقاتی خود بهدست آورند.
